O objetivo dessa dissertação foi analisar os itens de Biologia apresentados no Exame Nacional do Ensino Médio (ENEM), no período de 2009 a 2014, conforme as dimensões da análise do conhecimento e da demanda cognitiva da Taxonomia de Bloom Revisada. Em adição, foi verificado a congruência parcial entre os conteúdos presentes nestes itens, a matriz de referência do ENEM e a Proposta Curricular do Estado de São Paulo de 2008. Resumidamente, foram caracterizados 96 itens a partir da elaboração de uma sentença descritora para cada um por diversos profissionais da área. Em relação aos objetos do conhecimento ou conteúdos analisados foi possível verificar que uma porcentagem significativa de itens, cerca de 36%, avaliou conceitos de Ecologia. Pela análise da tabela bidimensional, a maioria dos itens de biologia do referido período estão localizados em domínios com demandas de baixa ordem cognitiva (LOCS), em contraste a apenas 14,6% dos itens associados às demandas de alta ordem cognitiva (HOCS). Seguindo-se os preceitos de Web, foi verificado que: (i) a categoria “categorical concurrence” não foi plenamente satisfatória entre a Matriz de Referência e os itens, pela não contemplação de vários objetos de conhecimento; (ii) O critério de alinhamento “range of knowledge correspondance” indicou que houve uma boa congruência entre o que é avaliado nos itens e o currículo de biologia do Estado de São Paulo e (iii) “Depth of knowledge consistency” houve pouca congruência por privilegiar mais itens LOCs em detrimento ao HOCs. Este trabalho demonstrou de forma concisa e elegante que a verificação da congruência entre os itens de Biologia aplicados no ENEM e seus respectivos documentos norteadores precisa ser aprimorada através de uma readequação dos itens a serem contemplados em futuras provas do ENEM.